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玉米转?#23478;?#23376;导入拟南芥研究镉离?#26377;?#36843;耐受机制

合作老师:华?#29616;?#29289;园 贺立龙

文章下载链接:http://www.dtbgs.tw/uploads/tmp/genedenovo-resume-1467363955.1458149.pdf

基迪奥新文章,研究玉米转?#23478;?#23376;在拟南芥镉离?#26377;?#36843;耐受中的调控机制。发表在Plant Physiology杂志上,IF 6.84。

研究背景

镉离子是土壤重金属污染的其中一种,会影响植物生长,并?#39029;?#26399;慢性摄入镉离子会造成很多健康问题,如癌症、心血管疾病等。因此,研究农作物对镉离?#26377;?#36843;的耐受机制,有助于我们进行作物改?#32908;?/span>
之前有报道指出,氧化应激蛋白(oxidative stress 2,OXS2)在拟南芥压力应激和压力逃避方面发挥重要作用。其中,在压力逃避方面,OXS2通过激活下游一些开花基因如SOC1,从而促进植物繁殖、保证植物生存。但OXS2是如何激活压力耐受信号通路却不清楚。
由于本文作者主要是想研究玉米这种经济作物,因此选择转基因的方法,在模式生物拟南芥中研究与鉴定OXS2激活下游信号通路的靶基因。

文章总体研究思路

研究结果
1. Blast比对预测拟南芥OXS2基因在玉米中的两个同源基因
结果:?#19994;?#20102;两个同源基因:ZmOXS2b和ZmO2L1,并且这两个基因在镉离子处理下的玉米中表达量?#31995;?#20102;2-3倍,说明这两个同源基因可响应镉离?#26377;?#36843;。

2. 将玉米同源基因导入拟南芥中,并检测其对镉离子的耐受性
将ZmOXS2b和ZmO2L1转基因导入野生型拟南芥和oxs2-1、o2l1-1突变体中,并检测四株转基因拟南芥对镉离子的耐受性。结果发现,导入玉米同源基因后,拟南芥对高浓度镉离子的耐受性增强,与非转基因植株相比,根生长更长、嫩芽生长更快。

                                 

3. RNA-seq检测差异表达基因
然后利用RNA-seq,检测转基因拟南芥和非转基因拟南芥在镉离?#26377;?#36843;下基因表达的差异变化。差异表达分析结果显示,共有30个差异表达基因在ZmOXS2b与ZmO2L1转基因植株共有(维恩图交集部分),这些基因在两种转基因植株中表达模式相似(图B)。其中14个基因与应激、金属离子运输相关。


备注:作者给这30个DEG从1-30命名了。

4. qPCR验证RNA-seq结果
对这30个共有DEG进行qPCR验证,其中8个DEG与非转基因植株相比,基因表达量变化最大(3.6~13.9倍)(上图 C)。这8个DEG甚至在没有镉处理的情况下?#19981;?#22312;转基因植株中表达?#31995;鰲?/span>
这8个DEG分别是:DEG7,DEG11,DEG19,DEG20,DEG21,DEG23,DEG24,DEG30

5. 体内体外实验验证ZmOXS2b和ZmO2L1激活DEG启动子上的转?#23478;?#23376;结合位点BOXS2 motif

得到了转入玉米基因后表达量?#31995;?#30340;基因后,那么下一步就要研究这两个玉米OXS2基因是怎样与拟南芥的靶向基因相互作用的。之前有报道指出,AtOXS2可通过结合一段富含CT的9bp长的motif来激活启动子,这段motif称为BOXS2。那么,我们可以猜测,玉米OXS2基因可能也是通过转?#23478;?#23376;结合的方法,激活下游靶向基因的表达的。因此,对上一步得到的8个DEG进行转?#23478;?#23376;结合位点计算机预测,发现DEG11,DEG21,DEG23的启动子区都含有潜在的BOXS2转?#23478;?#23376;结合序?#23567;?/span>然后作者通过体外荧光素酶报告基因实验和体内ChIP-qPCR实验,来验证计算机预测的结果,验证ZmOXS2b和ZmO2L1是否是通过结合BOXS2 motif来激活启动子的。

体外荧光素酶报告基因实验:将8个DEG的启动子与荧光素酶报告基因融合(图A)

体内ChIP-qPCR实验:拟南芥中导入含有FLAG标签的ZmOXS2b和ZmO2L1,然后用FLAG抗体共沉淀,并qPCR验证DNA表达量(图B)

结果:体外实验和体内实验的结果都发现,只有这三个含有BOXS2  motif的DEG的结果为阳性,说明ZmOXS2b和ZmO2L1是通过转?#23478;?#23376;的方式,结合BOXS2元件,从而激活下游靶向基因的启动子。这结果?#33756;?#26126;实验验证的结果与计算机预测的结果高度一致。

6. 过表达8个DEG检验能否增强拟南芥对镉离子的耐受性
然后作者构建了这8个DEG的过表达载体,转入拟南芥中过表达这些基因,发现只有DEG23能够增强拟南芥对镉离子的耐受性,并?#25233;?#36807;表达DEG23已经能够增强拟南芥对镉离子的耐受性了,说明这个基因在缓解镉离子毒性中起着很重要的作用。
DEG23编码一个甲基化转移?#31119;?#22240;此被命名为CIMT1。(在CIMT1过表达系,CIMT1表达量?#31995;?#20102;14-17倍) 

7.验证ZmOXS2b和ZmO2L1确实是通过结合BOXS2序列来激活CIMT1启动子的
秉着严谨的科学态度,作者又在目标基因CIMT1启动子上设计了四对引物(如下图), 进行ChIP-qPCR来检验ZmOXS2b和ZmO2L1是否通过结合BOXS2序列来激活CIMT1启动子。

结果:
只有包含了BOXS2 motif(图中黑色部分)的F12和F20引物对的ChIP-qPCR结果是阳性的,说明ZmOXS2b和ZmO2L1确实是通过结合BOXS2序列来激活启动子,并且这种作用并不依赖于镉离子(也做了?#24739;?#38217;的处理,结果同样是阳性)。

总结:
其实这两个玉米氧化应激蛋白,就是转?#23478;?#23376;,文章通过将这两个同源基因导入拟南芥,在模式生物中研究这两个转?#23478;?#23376;的下游靶向基因,通过计算机预测、体内体外实验,逐步缩小?#27573;В?#26368;终?#19994;?#20102;一个靶标基因CIMT1,这个基因启动子上的BOXS2 motif可以结合玉米转?#23478;?#23376;,从而?#24739;?#27963;表达,缓解镉离子对植株的毒性。

展望:
其实玉米才是这个实验室的目标研究作物。这篇文章?#19994;?#25311;南芥CIMT1基因后,作者展望了可以通过?#39029;鯟IMT1在玉米中的同源基因,然后研究这个同源基因能否在玉米镉离?#26377;?#36843;中也发挥相似的作用。

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